• 发布日期：2019-04-23
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深圳子科生物报道：自从CRISPR基因组编辑技术问世以来，它已经显示出了治疗许多棘手疾病的巨大希望。然而，科学家们一直在努力确定与治疗有关的细胞类型的潜在非靶向效应，这仍然是临床转化的主要障碍。现在，Gladstone研究所和创新基因组学研究所（IGI）的一组科学家与AstraZeneca合作开发了一种可靠的方法来实现这一点。

CRISPR通过在特定位置切割DNA来编辑一个人的基因组。挑战在于确保该工具不会在DNA上的其他地方进行切割，即所谓的“脱靶效应”，可能会产生不可预见的后果。

《Science》杂志的一项研究，两位第一作者，Beeke Wienert和Stacia Wyman，找到了解决这个问题的新方法。

“当CRISPR切割时，DNA就会断裂，”Wienert博士说，他之前在Jacob E.Corn的IGI实验室工作，现在是Gladstone研究所Bruce R.Conklin实验室的博士后学者。“因此，为了生存，细胞招募了许多不同的DNA修复因子到基因组中的特定位置来修复断裂，并将切割端重新连接在一起。我们认为，如果我们能找到这些DNA修复因子的位置，我们就可以确定被CRISPR切割的位置。”

为了验证他们的想法，研究人员研究了一组不同的DNA修复因子。他们发现其中一个叫MRE11的是对切口的第一反应者。根据MRE11，科学家们开发了一种新技术，名为DISCOVER-Seq，可以识别出CRISPR在基因组中切割的的确切位置。

Gladstone的高级研究员兼IGI的副主任Conklin博士解释说：“人类的基因组非常庞大，如果你打印出全部DNA序列，你最终会得到一部16层楼高的小说。当我们想用CRISPR切割DNA时，就好像我们要在小说的某一页上删除一个特定的词。”

MRE11标记Cas9 DNA断裂位点

“你可以把DNA修复因子看作是书中添加的不同类型的书签，”他说。“虽然有些人可能会为整个章节添加书签，但MRE11是可以检索到更改后的确切字母的书签。”

目前存在不同方法来检测CRISPR的脱靶效应。然而，它们有局限性，从产生假阳性结果到杀死正在被检测的细胞。目前最常用的方法仅限于在实验室培养的细胞中使用，不包括在病人源干细胞或动物组织中使用。

“因为我们的方法依赖于细胞的自然修复过程来识别切口，所以已经证明它的侵入性小得多，而且更可靠，”Conklin博士说，他现在在苏黎世ETH管理一个实验室。“我们能够在诱导多能干细胞、患者细胞和小鼠体内测试我们的DISCOVER-Seq，研究结果表明，这种方法可能用于任何系统，而不仅仅是实验室。”

DISCOVER-Seq方法通过扩大应用至新的细胞类型和系统，也揭示了CRISPR编辑基因组所用机制的新见解，这将有助于更好地理解该工具的生物学原理。

加州大学旧金山分校医学遗传学和分子药理学教授Conklin说：“新方法大大简化了识别脱靶效应的过程，同时也提高了结果的准确性。这可以让我们更好地预测基因组编辑在临床环境中的作用。因此，它是改善临床前研究和使CRISPR治疗更接近实际患者需要的关键步骤。”

原文检索：Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq